我国每年约有近一千万人软骨损伤，软骨缺陷相关疾病患者也逐年增多。由于关节处软骨组织无血管结构，且生理结构复杂，损伤后的治疗和修复都非常困难。组织工程领域通常根据关节软骨的软骨、过渡层和软骨下骨多级结构设计仿生层级支架进行骨软骨缺损修复。然而，层级支架相邻两层的力学强度差异会导致应力集中和支架脱层等问题，影响修复效果。而现有关于连续梯度支架的有限研究则存在功能性成分单一且缺乏空间分布调控，难以满足骨软骨缺损不同部位差异化需求的问题。

北京航空航天大学生物与医学工程学院、国家医学攻关产教融合平台、生物力学与力学生物学教育部重点实验室、北京生物医学工程高精尖创新中心、高端医疗装备与器械工信部重点实验室樊瑜波教授团队开发了一种具有连续力学强度梯度和多种功能性金属元素梯度的新型水凝胶用于骨软骨缺损的功能性再生。通过构建接枝碳碳双键的磁性掺镁羟基磷灰石颗粒，经磁场诱导实现其在聚乙二醇二丙烯酸酯/海藻酸钠水凝胶中的梯度分布。随后利用Mn²⁺梯度扩散的后修饰技术，形成反向Mn²⁺/磁性掺镁羟基磷灰石双梯度体系（图1）。该水凝胶具有连续力学强度梯度，有效减弱了层级梯度水凝胶层间应力集中的问题。Mn²⁺和磁性掺镁羟基磷灰石的反向按需梯度分布分别增强了骨髓间充质干细胞的软骨向和成骨向分化。水凝胶整体显著促进大鼠膝关节全层骨软骨缺损的功能性再生，为表现出生理梯度的组织/界面组织的再生提供了新的选择。相关工作以“具有Mn²⁺/磁性掺镁羟基磷灰石按需分布的连续力学梯度水凝胶用于骨软骨功能性再生”（“Continuous mechanical-gradient hydrogel with on-demand distributed Mn²⁺/Mg-doped hydroxyapatite@Fe₃O₄ for functional osteochondral regeneration” ）为题发表在《Bioactive Materials》。该论文通讯作者为樊瑜波教授与李萍教授、以及南方医科大学第三附属医院王晓刚教授，第一作者为北航博士研究生许俊伟和崔毅，北京航空航天大学为第一完成单位。

图1. 连续梯度水凝胶的制备和生物医学应用

该研究构建了一种磁性颗粒FMHM作为磁场响应媒介，通过在Fe₃O₄纳米颗粒上沉积针状掺镁羟基磷灰石得到Fe₃O₄@MgHA，随后再接枝硅烷偶联剂γ-（甲基丙烯酰氧基）丙基三甲氧基硅烷得到磁性颗粒FMHM，使其能够键合到水凝胶网络中（图2）。

图2. 磁响应性颗粒FMHM的制备表征

通过磁场诱导磁性颗粒FMHM在聚乙二醇二丙烯酸酯/海藻酸钠预聚物溶液中梯度分布，经过热交联以及Mn²⁺的半浸泡扩散交联，制备了具有连续力学强度梯度的水凝胶（CGGel）。连续梯度水凝胶CGGel具有明显的梯度多孔结构，有利于细胞渗透和血管生成。水凝胶显示出从顶部到底部逐渐增加的Fe元素分布和缓慢减少的Mn元素分布，表明水凝胶中具有反向梯度分布的Mn²⁺和磁性掺镁羟基磷灰石，同时也赋予了CGGel水凝胶梯度磁性特性（图3）。

图3. 连续梯度水凝胶的梯度表征

为了评估该连续梯度水凝胶的力学性能，构建了均匀水凝胶UGel和层级梯度水凝胶HGGel（图4），结果显示均匀水凝胶UGel的力学模量稳定不变，层级梯度水凝胶HGGel的力学模量呈阶梯式梯度变化，而连续梯度CGGel的力学模量从顶部到底部呈现连续增加的趋势。有限元模拟结果进一步表明CGGel的连续梯度结构显著弱化了层级水凝胶层间应力突变问题，具有更接近天然骨软骨的梯度力学特性。

图4. 连续梯度水凝胶与均匀和分层水凝胶的比较

体外实验中（图5），连续梯度支架CGGel上部分由于具有相对较低的力学模量和含有的Mn²⁺显著增强了骨髓间充质干细胞BMSCs软骨标志基因SOX9、Col-II和ACAN的表达。而连续梯度支架CGGel下部分由于具有更高的力学模量和含有的磁性掺镁羟基磷灰石则显著促进了BMSCs成骨标记基因ALP、Runx2和Col-I的表达。此外还发现力学敏感因子YAP1的表达和核定位与软骨标记基因SOX9在软骨向分化中呈负相关，而与成骨标记基因Runx2在成骨向分化中呈正相关。本研究构建的连续梯度水凝胶能够有效调控BMSCs的软骨向和成骨向分化，并且可能通过力学敏感因子YAP1的梯度表达来实现调控。

图5. 连续梯度水凝胶对BMSCs软骨/成骨分化的影响

在大鼠全层骨软骨缺损修复中，连续梯度水凝胶CGGel组以及水凝胶联合3-15 mT梯度磁场的CGGel+MF组在再生软骨填充、关节软骨表面光滑度、以及新生软骨下骨的骨体积分数和骨小梁数量等方面均具有显著促进效果，体现其在软骨-骨界面修复和组织整合方面的优越性（图6）。免疫组化和免疫荧光染色显示，CGGel和CGGel+MF组的软骨层中Col-II表达显著上调，而软骨下骨层中Col-I表达明显增强，且YAP1的表达在软骨层和软骨下骨层中呈现相反的调控趋势（图7）。结果表明，该连续梯度水凝胶能够显著促进骨软骨缺损的功能性再生，而结合梯度磁场刺激可以进一步增强再生效果。

图6. 连续梯度水凝胶的体内骨软骨再生能力

图7. 免疫组织化学染色分析

综上所述，本研究构建了具有反向Mn²⁺/磁性掺镁羟基磷灰石梯度按需分布的连续力学强度梯度水凝胶，验证了其较均匀水凝胶和层级梯度水凝胶在骨软骨缺损一体化修复中的优越性，为开发仿生功能性连续梯度支架提供了新的思路，并为理解骨软骨缺损修复机制和临床治疗提供了新的路径。该多功能性金属协同的连续梯度水凝胶还有望在其他梯度界面结构组织修复中得到应用，为临床治疗提供更有效的手段。

该研究得到了国家自然科学基金（52072015, 62273019, 82350003, 12332019, U20A20390)，高等学校学科创新引智计划111 (B13003），以及北航博士研究生卓越学术基金（BY2010154）资助。